Fontaine bắt đầu sự nghiệp sân khấu trong vở "Call It a Day" của tác giả Dodie Smith năm 1935 và sớm ký hợp đồng với Công ty điện ảnh RKO Pictures (Radio-Keith-Orpheum Pictures). Bà xuất hiện lần đầu trên phim No More Ladies (cũng năm 1935) trong vai Caroline, một vai nhỏ, ghi nghệ danh là "Joan Burfield".[12]

Sau đó, bà đóng thêm mấy vai nhỏ trong các phim A Million to One và Quality Street (vai Charlotte Parrat, không ghi tên) do Katharine Hepburn đóng vai chính. Cả hai phim đều sản xuất trong năm 1937. Công ty "RKO Pictures" coi Fontaine như một ngôi sao đang lên, cho bà đóng vai chính trong phim The Man Who Found Himself (cùng năm 1937), và quảng cáo bà như "một nhân vật mới của RKO Pictures" sau phần gìới thiệu các người tham gia phim này trên màn ảnh.[13] Sau đó Fontaine đóng vai chính cùng với Fred Astaire trong phim A Damsel in Distress (1937) – phim đầu tiên của Fred Astaire với Công ty RKO Pictures mà không có Ginger Rogers, tuy nhiên khán giả đã bị thất vọng và phim này thất bại. Fontaine tiếp tục đóng các vai nhỏ trên nhiều phim, trong đó có phim The Women (1939), nhưng không gây được ấn tượng lớn, nên bà bị sa thải khi hợp đồng hết hạn trong năm 1939.[12]

Vận may của Fontaine đã đến trong dịp bà tham dự một bữa tiệc buổi tối, khi bà thấy mình ngồi bên cạnh nhà sản xuất phim David O. Selznick. Fontaine và Selznick bắt đầu thảo luận về cuốn tiểu thuyết Rebecca của Daphne du Maurier, và Selznick yêu cầu bà tham gia buổi diễn thử vai một nữ anh hùng vô danh. Fontaine đã phải chịu đựng một loạt 6 tháng mệt mỏi về các buổi diễn thử bộ phim, cùng với hàng trăm diễn viên khác, trước khi đoạt được vai diễn, trước sinh nhật thứ 22 của mình.

Phim Rebecca, do Laurence Olivier và Fontaine đóng vai chính, đánh dấu sự khởi đầu của đạo diễn người Anh Alfred Hitchcock trên đất Mỹ. Năm 1940, khi phim được phát hành đã có nhiều bài bình luận khen ngợi, và Fontaine được đề cử cho Giải Oscar cho nữ diễn viên chính xuất sắc nhất,[12] (nhưng Fontaine không đoạt giải này trong năm đó, mà là Ginger Rogers đoạt giải về vai diễn trong phim Kitty Foyle). Tuy nhiên, năm sau Fontaine đã đoạt Giải Oscar cho nữ diễn viên chính xuất sắc nhất về vai Lina McLaidlaw Aysgarth trong phim Suspicion, đóng cặp với Cary Grant, cũng do Hitchcock đạo diễn.[12] Đây là giải Oscar về diễn xuất duy nhất trong một phim do Hitchcock đạo diễn.[2]

Trong thập niên 1940, Fontaine rất xuất sắc trong các phim lãng mạn đầy kịch tính. Trong số các bộ phim đáng nhớ của bà trong thời gian này là phim The Constant Nymph (1943) (mà bà đã được đề cử lần thứ 3 cho Giải Oscar),[12]Jane Eyre (1943), Ivy (1947) và Letter from an Unknown Woman (1948).

Trong thập niên 1950 sự thành công về điện ảnh của Fontaine hơi bị giảm sút, và bà cũng bắt đầu xuất hiện trên truyền hình và trên sân khấu. Bà nhận được các bài bình luận tốt cho vai Laura trên sân khấu Broadway vào năm 1954 trong vở Tea and Sympathy đóng cặp với Anthony Perkins. Bà cũng xuất hiện trong rất nhiều show phát thanh trong thập niên 1940 cho Lux Radio Theater.

Trong thập niên 1960, Fontaine xuất hiện trong nhiều vở kịch, trong đó có Private Lives, Cactus Flower và vở The Lion in Winter của Áo. Phim kịch chót của Fontaine là phim The Witches (1966), trong đó bà cũng là người đồng sản xuất. Fontaine cũng tiếp tục diễn xuất trên phim và truyền hình trong các thập niên 1970 và 1980, và được đề cử cho Giải Emmy về vai diễn trong loạt phim truyền hình tình cảm ướt át Ryan's Hope năm 1980.

Vai diễn cuối cùng của Fontaine trên truyền hình là trong phim truyền hình Good King Wenceslas năm 1994, sau đó bà lui về nghỉ hưu tại ngôi biệt thự riêng Villa Fontana, ở Carmel-by-the-Sea, California, dành thời giờ chăm sóc các con chó và ngôi vườn của mình.[14]